İngiliz fizikçi Robert Hooke’un mantar dokusunu mikroskop altında inceleyerek gördüğü yapılara “hücre” adını verdiği 1665 yılından bu yana mikroskopi teknolojileri büyük bir dönüşüm geçirdi.

17. ve 18. yüzyıllarda kullanılan düşük görüntü kalitesine sahip mikroskoplar, hücrelerin yalnızca temel yapılarını görmeye imkân veriyordu. Günümüzdeki gelişmiş cihazlar ve görüntüleme teknikleri ise yüksek büyütme oranlarının yanında son derece ayrıntılı görüntüler sunuyor. Bazı yöntemlerle 10 nanometre veya daha küçük yapılar bile görüntülenebiliyor. Bir nanometre, metrenin milyarda birine karşılık geliyor.

Çağdaş mikroskopi teknikleri, hücrelerin içinde veya yüzeyinde bulunan belirli moleküllerin tanımlanmasını da sağlıyor. Hatta bazı moleküllerin canlı hücrelerde ve fareler gibi bütün hâlindeki canlı organizmalarda zaman içindeki hareketleri takip edilebiliyor.

İşte hücresel ve moleküler yapıların bilinmeyen ayrıntılarını ortaya çıkaran en ileri 10 mikroskopi yöntemi:

1. Yakın alan taramalı optik mikroskopi

Yakın alan taramalı optik mikroskopi (Near-Field Scanning Optical Microscopy–NSOM), geleneksel ışık mikroskopisinin kırınım sınırını aşarak bir örnekteki nanometre ölçeğindeki yapıların görüntülenmesini sağlıyor.

Kırınım sınırı, birbirine çok yakın yapıların ayrı ayrı seçilebilmesini engelliyor. Geleneksel mikroskoplarda bu sınır genellikle görüntülemede kullanılan ışığın dalga boyunun yarısından daha az olan mesafeler için geçerli. Görünür ışığın en kısa dalga boylarında bu değer yaklaşık 200 nanometreye karşılık geliyor.

NSOM yönteminde ışık dalgaları, kırınım sınırının altındaki ayrıntıların ayırt edilebilmesi için örnek yüzeyine son derece yakın bir noktadan gönderiliyor. “Yakın alan” adı da yöntemin bu özelliğinden geliyor.

Teknik yalnızca hücre yüzeyi gibi örnek yüzeylerinin incelenmesiyle sınırlı olsa da yatay doğrultuda yaklaşık 20 nanometre, dikey doğrultuda ise 2 ila 5 nanometre arasında çözünürlüğe ulaşabiliyor. Kırınım sınırının altındaki yapıları görüntüleyebildiği için süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemlerinden biri kabul ediliyor.

2. Atomik kuvvet mikroskopisi

Atomik kuvvet mikroskopisi (Atomic Force Microscopy–AFM), örnek yüzeylerinin çok yüksek çözünürlükle incelenmesini ve yüzey özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinilmesini sağlıyor.

Bu yöntemde yalnızca birkaç atom genişliğinde olan son derece sivri bir uç, örneğin yüzeyi üzerinde hareket ettiriliyor. Uç ile örnek yüzeyi arasındaki kuvvet ölçülerek bir sinyal elde ediliyor.

Ortaya çıkan sinyal, yüzeyin topografik özelliklerini tanımlayan verilere dönüştürülebiliyor. Yüzey kuvveti taramasından elde edilen bilgiler kullanılarak örneğin üç boyutlu görüntüsü oluşturulabiliyor.

Atomik kuvvet mikroskopisi biyoloji alanında hücre davranışlarını, hücreler arasındaki etkileşimleri ve hücre yüzeylerinin belirli özelliklerini araştırmak için kullanılıyor.

3. Lazer taramalı konfokal mikroskopi

Lazer taramalı konfokal mikroskopi, biyolojik örneklerin derinliklerine kadar görüntülenebilmesine olanak tanıyor. Yöntem, odak düzleminin dışında kalan bölgelerden gelen görüntü bilgilerini ortadan kaldırıyor veya azaltıyor. Böylece sınırları çok daha keskin ve net görüntüler elde ediliyor.

İlk lazer taramalı konfokal mikroskobun 1960’ların sonu ile 1970’lerin başında geliştirilmesi, mikroskopi alanında önemli bir ilerlemeye işaret etti.

Lazer teknolojilerinin, algılayıcıların, filtrelerin ve hücrelerle dokulardaki son derece belirli hedeflere bağlanabilen floresan kimyasalların gelişmesi, konfokal mikroskopiyi biyolojik araştırmaların temel araçlarından biri hâline getirdi.

4. Yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi

Bir başka süper çözünürlüklü görüntüleme tekniği olan yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi (Structured Illumination Microscopy–SIM), geniş alan mikroskoplarının aydınlatma ve görüntüleme kapasitesini geliştirmek amacıyla oluşturuldu.

Geniş alan mikroskopları, örneğin görece büyük bir bölümünün aynı anda görüntülenmesine imkân veriyor. SIM yönteminde ise örnekten algılanan, uzamsal açıdan koherentsiz floresan ışımalar Fourier dönüşümleri kullanılarak yeniden oluşturuluyor ve dijital olarak filtreleniyor.

Bu matematiksel işlem sayesinde örneklerin kırınım sınırını aşan çözünürlüklerde görüntülenmesi mümkün hâle geliyor.

5. Seçici düzlem aydınlatmalı mikroskopi ve ışık tabakası floresan mikroskopisi

Seçici düzlem aydınlatmalı mikroskopi (Selective Plane Illumination Microscopy–SPIM) veya ışık tabakası floresan mikroskopisinde (Light-Sheet Fluorescence Microscopy–LSFM), örneğin yalnızca odaklanılan düzlemi aydınlatılıyor.

Bu özellik, örneklerin dikey doğrultuda optik kesitler hâlinde incelenebilmesini sağlıyor. Yöntem floresan mikroskopi teknikleriyle birleştirildiğinde araştırmacılar, örneklere ışık kaynaklı hasar vermeden onları gerçek zamanlı, yüksek çözünürlükte ve önemli bir derinliğe kadar görüntüleyebiliyor.

SPIM ve LSFM, özellikle canlı hücrelerin ve embriyolar gibi bütün hâlde bulunan doku örneklerinin zaman aralıklı görüntülenmesinde sıklıkla kullanılıyor.

6. Seri zaman kodlamalı güçlendirilmiş mikroskopi

Seri zaman kodlamalı güçlendirilmiş mikroskopi (Serial Time-Encoded Amplified Microscopy–STEAM), çok yüksek hızda görüntü alınmasını sağlayan bir teknoloji.

Yöntem, “fotonik zaman germe” olarak bilinen bir olgudan yararlanıyor. Örnekten mikroskoba yansıyan ışık sinyalleri, uzamsal dağılım aracılığıyla yavaşlatılıyor.

Bir fotodetektör, güçlendirilmiş ve zaman açısından uzatılmış bu sinyalleri algılıyor. Sinyaller daha sonra dijital olarak işlenerek gerçek zamanlı bir görüntüye dönüştürülüyor.

Bu teknik, özellikle canlı hücrelerdeki kimyasal sinyalleşme gibi çok hızlı ve dinamik süreçlerin görüntülenmesinde kullanılıyor.

7. Uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopisi

Uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopisinde (Stimulated Emission Depletion–STED), örnekler önce floresan boyalarla işaretleniyor. Ardından bu floresan sinyaller optik sistem tarafından seçici biçimde baskılanıyor.

Sistemde iki lazer ışını kullanılıyor. Birinci lazer, floresan molekülleri uyarıyor. İkinci lazer ise bu molekülleri hemen yeniden temel enerji durumuna döndürüyor.

Ancak ikinci lazer ışını, odak noktasının merkezinde sıfır yoğunluk gösterecek biçimde düzenleniyor. İki ışın üst üste getirildiğinde aydınlatılan alan küçülüyor ve yalnızca odak gücünün merkezde toplandığı çok küçük bir bölgede floresan sinyal kalıyor.

Süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemlerinden biri kabul edilen STED, proteinlerin ve diğer moleküllerin nanometre ölçeğindeki ayrıntılarının ayırt edilmesini sağlıyor.

8. Diferansiyel girişim kontrast mikroskopisi

Diferansiyel girişim kontrast mikroskopisi (Differential Interference Contrast–DIC), boyanmamış ve saydam örnekleri görüntülemek için kullanılıyor. Görüntüdeki kontrast, örneğin farklı bileşenlerinin kırılma indisleri arasındaki farklılıklardan oluşturuluyor.

Teknik, saydam bir örnekten geçen ışığın fazındaki değişimlerin görüntüde parlaklık farklılıkları olarak gösterildiği faz kontrast mikroskopisine benziyor. Ancak DIC yöntemi daha yüksek çözünürlük sağlayabiliyor.

Diferansiyel girişim kontrast mikroskopisi; kültür ortamında yetiştirilen hücrelerin, kan yaymalarının ve bakteri ya da diyatom gibi tek hücreli organizmaların görüntülenmesinde yaygın olarak kullanılıyor.

9. Genleşme mikroskopisi

Genleşme mikroskopisi, nanometre ölçeğinde uzamsal çözünürlük elde etmek için mikroskobun veya görüntüleme sisteminin parçalarını değiştirmek yerine doğrudan örneğin fiziksel yapısını değiştiren yeni bir yöntem.

Bu teknikte sabitlenmiş hücreler ve dokular, özel bir polimer jel ile işleniyor. Jel daha sonra kimyasal olarak şişirilerek örneğin önemli ölçüde genişlemesi sağlanıyor. Kaynak metne göre bu genişleme yaklaşık iki büyüklük mertebesine, başka bir ifadeyle yaklaşık 100 kata yaklaşabiliyor.

Genleşme sonucunda daha önce birbirine çok yakın oldukları için kırınım sınırının altında kalan yapılar fiziksel olarak birbirinden uzaklaşıyor. Böylece bu ayrıntılar geleneksel optik sistemlerle ayırt edilebilir hâle geliyor.

Bu süper çözünürlüklü teknik sayesinde araştırmacılar, 100 nanometreden daha küçük yapıların özelliklerini görüntüleyebiliyor.

10. Geçirimli elektron mikroskopisi

Geçirimli elektron mikroskopisi (Transmission Electron Microscopy–TEM), geliştirilen en güçlü mikroskopi teknikleri arasında yer alıyor. Yöntem, birkaç nanometre hatta tek nanometre ölçeğindeki yapıların görüntülenebilmesini sağlıyor.

TEM’de bir elektron demeti örneğin üzerine odaklanıyor. Elektronlar örneğin içinden geçerek yüksek oranda büyütülmüş bir elektron görüntüsü meydana getiriyor.

Oluşturulan görüntü, elektronların floresan bir ekran üzerinde yakalanmasıyla veya dijital olarak kaydedilmesiyle insan gözünün görebileceği hâle getiriliyor.

Geçirimli elektron mikroskopisi biyoloji alanında hücrelerden virüs parçacıklarına, tek tek proteinlerden diğer moleküllere kadar çok çeşitli yapıların görüntülenmesinde kullanılıyor.

Derleyen: Yağmur Saatcı